一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應用

　　1.本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應用。背景技術(shù)：2.紅色食品是指食品為紅色、橙紅色或棕紅色的食品。這類食品富含天然活性植物色素(如番茄紅素、花青素、辣椒紅素、甜菜紅素等)、胡蘿卜素、鐵、蛋白質(zhì)和部分氨基酸，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、b族維生素和多種無機鹽的重要來源，可以彌補粳米、白面中的營養(yǎng)缺失。科學研究表明，紅色食品有治療缺鐵性貧血和緩解疲勞的作用，對乳腺癌等腫瘤疾病有防治作用，給人以興奮感，有增加食欲，光潔皮膚，增強表皮細胞再生和防止皮膚衰老，預防感冒等作用。經(jīng)常食用紅色食品，可以進一步提高對主食中營養(yǎng)的利用率，山楂、紅參等食品還有治療癌癥的功效。被稱為“紅色生力軍。”營養(yǎng)學家認為，紅色蔬果最典型的優(yōu)勢在于它們都是富含天然鐵質(zhì)的食物，例如常吃的花生、大棗等都是貧血患者的天然良藥，也適合女性經(jīng)期失血后的滋補。所以，紅色蔬果，女人盡可放心多吃。紅色食品中還含有致病微生物的“殺手”一一巨噬細胞，可以有效地抵御感冒病毒等微生物，增強人體抵抗感冒的能力。3.但是上述涉及的紅色食品傳統(tǒng)的應用方法大多作為普通食品或者提取其中的活性天然植物色素進行開發(fā)利用，極少關(guān)注其中的蛋白質(zhì)類成分。科學研究發(fā)現(xiàn)，多種食物的蛋白水解物(小分子肽)具有較強的抗氧化能力，而市面上一些普遍的抗氧化劑如維生素e等,雖然能夠清除活性氧，但對已造成的損傷修復效果較弱且會產(chǎn)生副作用。本發(fā)明對紅色食品中的復合小分子肽進行開發(fā)利用，彌補了普通抗氧化劑不具有損傷后修復功能的缺陷,更全面地開發(fā)利用了紅色食品的營養(yǎng)價值。4.采用酶水解蛋白制備抗氧化肽是主流的方法，但由于許多蛋白酶有特異性的酶切位點及蛋白質(zhì)氨基酸序列的獨特性，因此選用不同的蛋白及酶組合對于生成具有獨特功能性的肽化合物具有重要意義。就現(xiàn)有的酶解方法而言，有些使用了無特異性或廣泛特異性的蛋白酶，這樣的生產(chǎn)重復性低并且會產(chǎn)生游離氨基酸，或是肽鏈會被水解的過小導致功能性降低，最后產(chǎn)物的收率也較低，總體而言還缺乏穩(wěn)定、高效制備抗氧化肽的方法。5.本申請的發(fā)明人在先申請cna公開了一種紅色食品復合小分子肽及制備方法和在細胞修復中的應用，包括以下原料：赤小豆、紅米、紅慧米、紅南瓜、花生、大棗、山楂、紅藜麥、枸杞子、洛神花、紅參；所述基于紅色食品原料的復合小分子肽的制備方法包括以下步驟:原料粉的制備；發(fā)酵產(chǎn)物的制備；酶解產(chǎn)物的制備；復合小分子肽成品的制備。本發(fā)明提出的復合小分子肽，具有純天然，無添加的特點，色澤鮮紅誘人，食欲感強，食用人群廣，口感好，營養(yǎng)價值高，具有修復受損細胞、延緩衰老、去除氧自由基、補氣血及增強免疫力的保健功效。但是，由于該多肽水解物中活性成分含量較低，特別是作為活性成分的adf的抗氧化性還有待進一步提高，由此所得到的多肽水解物除濕的效果有待進一步改進。技術(shù)實現(xiàn)要素：6.本發(fā)明的目的是提供一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應用。具體而言，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明擬采用如下的技術(shù)方案：7.本發(fā)明一方面涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽，其包括adfw和hadf。8.在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述adfw的含量為0.9wt％以上，hadf的含量為0.7wt％以上。9.本發(fā)明另一方面還涉及含有上述發(fā)酵型小分子肽的水解物，其中包含60wt％以上的短肽，所述短肽是指肽鏈長度為10個以下3個以上的肽。10.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物的制備方法，其特征在于通過如下步驟制備得到：11.(1)將重量份為赤小豆200～300；紅米紅慧米紅南瓜花生山楂紅糖大棗50～100；紅藜麥枸杞子子猴頭菇粉茯苓10?30；洛神花紅參破壁粉碎，溶解在水中；12.(2)加入纖維素酶和果膠酶的混合物，調(diào)節(jié)ph至4?5，加熱反應液至50?60℃，放入攪拌器中，酶促水解1?3小時；13.(3)水解之后加入胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶，攪拌均勻得到反應液，調(diào)節(jié)反應液的ph至7?8，加熱反應液至50?60℃，放入攪拌器中，酶促水解時間為2?4小時；14.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶，在ph6.5?7.5和50?60℃溫度下進行酶促水解3?5小時；15.(5)在熱處理使酶變性；16.(6)離心并回收液相；17.(7)先通過4?6kda膜對液相進行超濾和滲濾并回收滲透物；18.(8)再通過150?300da膜對來自超濾的滲透物進行納米過濾并回收滲余物；19.(9)進行冷凍干燥，得到水解物。20.本發(fā)明另一方面涉及上述小分子肽作為抗氧化劑和/或除濕中的應用。21.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物在除濕中的應用以及在制備治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹和/或皮膚瘙癢的藥物或食品中的應用。22.有益效果23.本發(fā)明通過采用合適的水解條件，制備得到了富含本發(fā)明小分子肽的水解物，本發(fā)明的小分子肽具有較高的抗氧化活性，由此所得到的多肽水解物對于除濕，特別是治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢具有重要意義。有望在抗衰老、美容方面取得功效。具體實施方式24.為了進一步理解本發(fā)明，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。25.如無特殊說明，本發(fā)明實施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。26.實施例1：27.(1)稱量赤小豆300g、紅米300g、紅慧米300g、紅南瓜300g、花生200g、山楂150g、紅糖150g、大棗100g、紅藜麥50g、枸杞子30g、猴頭菇粉30g、茯苓30g、洛神花30g及紅參30g；水清洗干凈，烘干去除水分并使用破壁機破壁粉碎，備用；28.(2)加入纖維素酶(2.0％/dm)和果膠酶(1.0％/dm)的混合物，調(diào)節(jié)ph至4.5，加熱反應液至55℃，放入攪拌器中，在40rpm的條件下反應，酶促水解2小時；29.(3)水解2小時之后加入胰蛋白酶(1.5％/dm)和菠蘿蛋白酶(2.0％/dm)，攪拌均勻得到反應液，調(diào)節(jié)反應液的ph至7.5，加熱反應液至55℃，放入攪拌器中，在40rpm的條件下反應，酶促水解時間為3h；30.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶(1.5％dm)，在ph7.0和55℃溫度下進行酶促水解4小時；31.(5)在85℃下熱處理45分鐘以使酶變性；32.(6)離心并回收液相；33.(7)先通過5kda膜對液相進行超濾和滲濾并回收滲透物；34.(8)再通過200da膜對來自超濾的滲透物進行納米過濾并回收滲余物；35.(9)進行冷凍干燥，得到水解物。經(jīng)過測試，所述水解物中包含62％重量的短肽、27％的多糖以及11％的其它物質(zhì)。36.比較例1：37.參照實施例1，其區(qū)別在于步驟(3)中不加入胰蛋白酶。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含47％重量的短肽、35％的多糖以及18％的其它物質(zhì)。38.比較例2：39.參照實施例1，其區(qū)別在于步驟(3)中不加入菠蘿蛋白酶。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含37％重量的短肽、32％的多糖以及31％的其它物質(zhì)。40.比較例3：41.參照實施例1，其區(qū)別在于先進行步驟(4)，再進行步驟(3)。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含53％重量的短肽、28％的多糖以及19％的其它物質(zhì)。42.對于上述水解產(chǎn)物，通過測定orac值(μmolte/mmol)和dpph值(μmolte/mmol)來比較其抗氧化活性，實驗結(jié)果如表1所示。43.表1：水解物抗氧化活性測試結(jié)果44.45.從上述比較結(jié)果來看，實施例1的抗氧化活性高于比較例1?3，由此說明實施例1的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性。46.對于由實施例1和比較例1?3所得到的水解物，分析其包含的短肽的含量，通過檢測發(fā)現(xiàn)，實施例1中豐度最高的短肽為adfw和hadf，其含量達到水解物的0.92％和0.76％，而在比較例中adfw和hadf的含量最高的是比較例3，僅為0.57％和0.53％。47.為了進一步確定是否是由于adfw和hadf的存在使得水解物的抗氧化活性較高，對于檢測出的豐度較高的短肽，使用通常的肽的化學合成方法即fmoc固相合成法來合成，作為抗氧化活性測定用的樣品，作為比較，以cna所得到的豐度最高的adf作為對照。對于合成的短肽，測定orac值(μmolte/mmol)dpph值(μmolte/mmol)，將各肽序列的分析結(jié)果匯總于表2。48.表2：短肽抗氧化活性測試結(jié)果[0049][0050]基于上表可以看出，通過同時包含表現(xiàn)出高orac值和表現(xiàn)出高dpph值的adfw和hadf，從而使得水解物的抗氧化性能全面優(yōu)異，特別是，相比于cna所公開的adf，本發(fā)明的肽具有更高的抗氧化活性。[0051]水解物除濕效果:[0052]一、臨床資料[0053]試驗方法：隨機、陽性藥對照臨床研究。[0054]安全性評價指標：一般體格檢查，血、尿、大便常規(guī)，肝、腎功能、心電圖，不良反應等。[0055]病例數(shù)：治療組40例，陰性對照組40例，陽性對照組40例，共120例,臨床表現(xiàn)丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。[0056]二、試驗藥品[0057]治療組：本發(fā)明實施例1所制備得到的水解物，每次10g，溫開水送服，每日3次。[0058]陰性對照組：不進行處理。[0059]陽性對照組：cna實施例1所制備的小分子肽溶液，每次40g(干物質(zhì)量為10g)，加熱后送服，每日3次。[0060]三、受試者治療[0061]療程：1周，觀察期內(nèi)，每天隨訪1次，除有嚴重不良反應者外，觀察1周后，一般不再進行隨訪。[0062]四、統(tǒng)計結(jié)果[0063][0064]從上表可以看出，采用本發(fā)明的水解物能夠有效緩解丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。此外，在觀察期間未見明顯不良反應，也未見肝、腎功能及造血系統(tǒng)損害，表明本發(fā)明的小分子肽使用安全。[0065]以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實施方式，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對在此公開的實施方案可進行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進和變化。